Thursday, January 12, 2017

PERBANDINGAN KERAGAMAN GENETIK ANTARA AYAM PEGAR ELLIOT (Syrmaticus ellioti) LIAR DAN PENANGKARAN MENGGUNAKAN DNA MITOKONDRIA

By  at 1:53 PM  , ,  No comments
BAB I PENDAHULUAN

1.1  Latar Belakang
Keanekaragaman genetik merupakan masalah besar dalam konservasi biologi  yang diakui oleh IUCN (Frankham et al., 2002). Dalam populasi keanekaragaman genetik mencerminkan potensi evolusi untuk beradaptasi dengan perubahan lingkungan baru. Oleh karena itu, selama beberapa tahun terakhir,banyak keragaman genetik dari jenis mamalia, burung, ikan, serangga dan tanaman yang terancam telah diteliti (Frankham et al., 2002). Sebagai konsekuensi langsung dan tidak langsung dari tindakan manusia, semakin banyak spesies atau populasi yang menghadapi perubahan lingkungan dan akibatnya ukuran populasi terus berkurang. Oleh karena itu hilangnya keanekaragaman genetik ini menjadi topik yang semakin penting dalam genetika konservasi (avise, 1994), dengan berkurangnya ukuran populasi efektif, perkawinan sedarah (inbreeding) terus meningkat, fragmen populasi terus terjadi dan faktor merugikan lainnya bertahan. Di sisi lain, dalam rangka meningkatkan ukuran populasi dan menyelamatkan spesies yang terancam atau terancam dari kepunahan, banyak dilakukan proyek perkembangbiakan antara populasi ayam yang ada di penangkaran . Karena sebagian besar dari populasi ayam penangkaran dari hasil inbreeding berukuran kecil, tidak mengherankan bukti menunjukkan bahwa populasi ayam penangkaran umumnya memiliki keragaman genetik yang lebih rendah dibandingkan dengan populasi ayam liar.
Elliot Pheasant (Syrmaticus Ellioti), yang dianggap sebagai "Rentan" di tahun 2003 IUCN Red List of Threatened Species (http://www.redlist.org), endemik China. Ukuran populasi yang diperkirakan akan cepat menurun karena hilangnya habitat yang sedang berlangsung dan diburu (Ding dan Jiang, 2000). Sejarah tawanan spesies ini dapat ditelusuri kembali dari tahun 1873 ketika Père David memperoleh spesimen individu dari Provinsi Fujian dan memulai penangkaran spesies di Paris (Knoder, 1983). Di bagian akhir abad ke-20, spesies tangkaran dibesarkan di beberapa kebun binatang di Cina, seperti Kebun Binatang Shanghai dan Ningbo Zoo (Zheng dan Wang, 1998). Saat ini, populasi ayam tangkaran di luar negeri diperkirakan 500-600 orang seperti dicatat oleh kebun binatang Amerika dan Aquarium Association (AZA) Regional stud book (Fuller dan Garson, 2000). Meskipun berbagai proyek mengenai adaptasi ekologi dan strategi konservasi telah dilakukan, sangat sedikit informasi mengenai keragaman genetik populasi liar atau penangkaran dari spesies yang ada.
Baru-baru ini, keragaman genetik telah diukur dengan menggunakan berbagai jenis data, termasuk karakter kuantitatif, kromosom, protein, loci DNA nuklir, DNA kloroplas, dan mtDNA. Dengan demikian tubuh meningkat dari data yang dihasilkan untuk studi di tingkat DNA. Urutan mtDNA menyediakan penanda warisan maternal dengan tingkat mutasi yang tinggi dan variasi yang tinggi yang diamati pada vertebrata. Selain itu, mtDNA dapat diurutkan dengan menggunakan sampel non-invasif, sehingga menjadi lebih cocok untuk spesies terancam dan hampir punah  ini.
   Dalam penelitian ini, meneliti apakah individu hasil tangkaran  dari Syrmaticus Ellioti menampilkan keragaman genetik yang rendah, seperti halnya dalam banyak pengamatan populasi kecil pada penangkaran yang terancam. Dalam tulisan ini, kami menilai keragaman genetik di antara individu-individu liar dan penangkaran darri Syrmaticus Ellioti, berdasarkan variasi haplotypic mtDNA urutan daerah kontrol. Alasan untuk kerugian keanekaragaman genetik yang hilang secara signifikan dari individu di penangkaran, terutama di Kebun Binatang Ningbo, dibahas. Kami kemudian membuat beberapa rekomendasi untuk manajemen genetic pada populasi Syrmaticus Ellioti yang ditangkarkan.    





BAB II MATERI DAN METODE

Sampel darah diperoleh dari 36 Syrmaticus Ellioti  di Kebun Binatang Ningbo, Provinsi Zhejiang. Semua individu berasal dari lima leluhur yang telah ditangkarkan (2 laki-laki dan 3 perempuan) yang diperkenalkan pada tahun 1988. Sebanyak 17 orang dari Syrmaticus Ellioti liar diperoleh dari Provinsi Zhejiang dan dua provinsi yang berdampingan lainnya, Provinsi Anhui dan Provinsi Fujian, yang pad dan darah sampel dikumpulkan untuk pemeriksaan (Tabel 1).

Tabel 1. Ringkasan Informasi dan Sampel dalam Penelitian ini
Groups
Site
N
Resource
Collected Year
Code
Wild
Anhui
6
Pad
2000
A1-6

Zhejiang
2
Pad
1985
Z1-5

Zhejiang
3
Blood
2002
Z1-5

Fujian
6
Pad
1985
F1-6
Pennangkaran
Ningbo Zoo
36
Blood
2002
C1-36
PCR amplifikasi, kloning dan sekuensing

      Genomic DNA diekstraksi menggunakan standar proteinase K pencernaan dan fenol / prosedur kloroform (Sambrook et al., 1989). Sebuah fragmen DNA sekitar 1153 bp diamplifikasi dari semua spesimen. PCR amplifikasi dilakukan pada PTC-200 Peltier Thermal Cycler di reaksi 50µl (primer DNA: Randi dan Lucchini, 1998). Profil siklus termal adalah sebagai berikut: pemanasan awal pada 95 ° C selama 4 menit; 30 siklus amplifikasi denaturizing pada 94 ° C selama 1 menit, annealing pada 59,5 ° C selama 1 menit dan perpanjangan pada 72 ° C selama 1 menit; dan inkubasi akhir pada 72 ° C selama 10 menit. PCR produk amplifikasi dipisahkan dan elluted dengan elektroforesis gel agarosa dan UNIQ-5 Kolom DNA Gel ekstraksi kit (Sangon, Cina), dan kemudian diikat ke PMD 18-T vektor (Takara, Cina). Produk disekuensing di kedua arah mengikuti metode ekstensi-dideoxy-rantai terminasi dengan primer universal (M13 + / M13) dan BigDye siklus terminator sequencing kit (Perkin Elmer) sesuai dengan prosedur.

Analisis Statistik
Multiple Sequence allignment diperoleh dengan menggunakan CLUSTALX (Thompson et al., 1997). Perbandingan urutan awal dan identifikasi haplotipe yang dilakukan menggunakan MEGA versi 2.1 (Kumar et al., 2001). Nilai jarak urutan, keragaman haplotipe (h), keragaman nukleotida (π) dan uji Tajima ini D netralitas selektif dilakukan oleh DnaSP versi 3.51 (Rozas dan Rozas, 1999).





BAB III HASIL

Diperoleh  Sekitar 1.153 bp dari pengurutan. Komposisi dasar termasuk 13,9% G, 26,6% A, 32,7% T dan 26,8% C, sesuai dengan karakteristik urutan daerah kontrol burung lainnya (Baker dan Marshall, 1997). Ini menegaskan bahwa data urutan awalnya berasal dari mtDNA daerah kontrol.
Untuk semua individu yang diperiksa, 53 posisi nukleotida variabel antara urutan yang ditetapkan 18 haplotype urutan CR lebih dari 53 individu. Ringkasan haplotipe disediakan pada Table2.

Tabel 2. Situs nukleotida polimorfik mendefinisikan 18 haplotype mitokondria antara Syrmaticus Ellioti liar dan penangkaran yang diperiksa.
Haplotypes
Nucleotide position
111
11122
2222222223
3334444455
5555666677
8888888999
000
3557837912
2233446991
3770266801
3457146979
2456669236
066
2043722822
4814492781
9256446468
2923285493
2625671181
427
A1
ACCCTACTCC
TATCACTCTT
AAACTCCGAT
TTCCCAGCCC
AGTTTTCTTC
TTT
A2
G . . . . . . . . .
....C.T....
.....TA..
........T.
..........
...
A3
....C.T.T.
..........
......TA..
........T.
..........
...
A4
......T.T.
........C.
......TA..
....T...T.
..........
...
Z1
...T..T...
..........
......TA..
........T.
..........
...
Z2
......T...
..........
GG....TAG.
..T.....T.
......TC..
...
Z3
......T...
....G.....
......TA..
......A.T
..........
...
Z4
C.C ..T.T.C
G.....TCTT
......TA..
........T.
G.........
...
Z5
......T.T.
..........
...AC.TA..
........T.
..........
.C.
F1
......T.T.
..........
......TA..
........T.
........CT
...
F2
.....GT.T.
.....T....
......TA..
.......TT.
.A........
...
F3
.T....T...
..........
..G...TA..
.A......T
...C......
...
F4
....C.T.T.
..........
.....TTA..
...T....T.
..........
...
F5
......T.T.
..........
......TA.C
.....T..T.
....CC....
C..
F6
C.C..T.T.C
......T.TT
......TA..
C.......T.
..........
..C
C1
......T.T.
...T......
......TA..
........T.
..........
...
C2
......T.T.
......C...
......TA..
........T.
..........
...
C3
..T...T.T.
..CT......
..G...TA..
........T.
..C.......
...

*: Haplotype A3 shared by the individuals A5
#: Haplotype C1 shared by wild individuals A4

Rata-rata Keragaman haplotype (h) diperkirakan 0,795, meskipun perbedaan keragaman genetik antara individu liar dan penangkaran terlihat jelas (h = 0,993, 0,584 masing-masing). Perbedaan keragaman genetik juga tercermin dalam estimasi keanekaragaman nukleotida (π) (Table3). Uji D Tajima itu mendeteksi bahwa kelompok liar berangkat dari model standar netral (P <0,01).
Tabel 3
Tabe 3. Keanekaragaman mtDNA yang diamati pada individu liar dan penangkaran
Groups
N
Nhap
D (%)
H
π* (%)
Tajima’s D
Captive
36
3
0.20
0.584±0.054
0.150±0.028
−2.13598#
Wild
17
16
0.60
0.993±0.023
0.628±0.085
0.52891
Total
53
18
0.30
0.795±0.045
0.330±0.049
        N: Jumlah individu;
        N hap: Jumlah haplotipe;
        D: Jarak urutan (keseluruhan berarti);
        h: Diversitas haplotype;
        π: keragaman nukleotida
       *Estimasi menggunakan Kimura 2-parameter jarak (Kimura, 1980)
       #Significant dari netralitas (P <0,01)

Distribusi dan frekuensi relatif dari semua delapan belas haplotype unik diilustrasikan pada Gambar. Fig.1.1. Enam belas haplotype yang diidentifikasi dalam tujuh belas individu liar, sementara hanya tiga haplotype yang diidentifikasi dalam tiga puluh enam individu penangkaran. Individu liar, A3 dan A5, berbagi haplotype yang sama. Selain itu, ada haplotype bersama oleh liar dan individu tawanan. Namun pada populasi penangkaran, tiga haplotype (C1, C2 dan C3) dibagikan secara luas di antara individu. Haplotipe C1, dengan frekuensi relatif tertinggi (55,56%), dibagi oleh dua puluh individu, dua belas individu haplotype C2 bersama (33,33%) dan empat individu haplotype  C3 bersama (11,11%).
Gambar 1.
Histogram distribusi dan frekuensi relatif mtDNA haplotipe individu liar dan penangkaran





BAB IV PEMBAHASAN

Perbedaan keragaman genetik pada individu liar dan penangkaran
Dari analisis yang dilakukan dalam penelitian ini, jelas bahwa individu liar memiliki keragaman genetik lebih tinggi dari individu-individu tangkapan. Distribusi haplotipe berbeda secara signifikan antara kedua kelompok. Hanya tiga haplotype didistribusikan secara luas di antara individu-individu tangkapan. mtDNA adalah penanda maternal yang diwariskan pada vertebrata, secara teoritis, tiga haplotype mtDNA dapat disumbangkan oleh keturunan individu penangkranan karena hanya tiga female  founder yang tercatat dalam Zoo Ningbo. Dalam penelitian ini tiga haplotype diidentifikasi di antara individu di penangkaran yang diberikan melalui tiga founder female. Sudah pasti bahwa rendahnya jumlah founder female adalah faktor besar yang mengakibatkan kurangnya jumlah dari haplotipe yang mengarah ke tingkat yang lebih rendah dari keanekaragaman haplotypic pada populasi di penangkaran. Apalagi populasi tangkaran itu bias terhadap haplotype penangkaran I. Distribusi haplotypic tidak proporsional pada populasi penangkaran yang mungkin terkait dengan campur tangan manusia dalam penangkaran seperti mengabaikan data genetik dan memfokuskan perhatian pada beberapa individu yang memiliki kemampuan  reproduksi yang baik.
Haplotype penangkaran pada penelitian ini juga dimiliki oleh satu individu dari Provinsi Anhui. Oleh karena itu mungkin bahwa tiga female founder yang telah dikumpulkan mungkin berasal dari Provinsi Anhui, dan bukan Provinsi Zhejiang, sebagai awal disebutkannya atau memiliki hubungan yang lebih dekat dengan garis keturunan individu dari Provinsi Anhui.
Hasil uji Tajima mengungkapkan bahwa kelompok liar berangkat dari model netral standar (P <0,01), faktor penyebab yang memungkinkan adalah bahwa terdapat sangat sedikit individu liar dalam penelitian ini berbanding dengan jumlah besar individu Syrmaticus Ellioti penangkaran yang ada.





BAB V PENUTUP


Seperti yang dinilai di atas, populasi penangkaran dari Syrmaticus Ellioti memiliki keragaman genetik lebih rendah dari populasi liar. Tidak ada keraguan bahwa pengurangan keragaman genetik memiliki kecenderungan terhadap kemampuan populasi untuk berkembang untuk mengatasi perubahan lingkungan baru dan mengurangi kesempatan mereka untuk tidak punah. Karena distribusi haplotipe dalam kelompok penangkaran menunjukkan hasil bias terhadap haplotipe C1 dan C2, perhatian khusus harus diberikan kepada individu dengan haplotype C3 ketika mempertimbangkan pengelolaan penangkaran. Hal ini diperlukan untuk meningkatkan reproduksi individu dengan haplotipe C3 untuk menghindari hilangnya gen berharga dari individu dengan haplotipe C3. Hal ini diduga bahwa informasi silsilah mengenai latar belakang genetik masing-masing leluhur bisa berguna diterapkan dalam manajemen praktis. Dengan bantuan itu, dimungkinkan untuk meminimalkan kerugian genetik dengan memilih individu dengan hubungan terendah dalam populasi, menjadi orang tua dari generasi berikutnya. Hal ini akan mengakibatkan tingkat tertinggi retensi variasi genetik.





DAFTAR PUSTAKA

Avise J. Molecular Markers, Natural History and Evolution. New York: Chapman and Hall; 1994.
 Baker AJ, Marshall HD. Mitochondrial Control Region Sequences as Tools for Understanding Evolution. In: Midell DP, editor. Avian Molecula Evolution and Systematics. San Diego, California: Academic Press; 1997. pp. 51–79.
 Ding P, Jiang SR. Fragmentation study of Elliot’s Pheasant in the west of Zhejiang Province. Chinese Zoology Reseach. 2000;21(1):65–69. (in Chinese)
 Frankham R, Ballou JD, Briscoe DA. Introduction to Conservation Genetics. UK: Cambrige University Press; 2002.
Fuller RA, Garson PJ. 2000. Pheasants. Status Survey and Conservation Action Plan 2000-04. IUCN, Gland, Switzerland and Cambridge, UK, and the World Pheasant Association, Reading, UK.
Kimura M. A simple method for estimating evolutionary rate of base substitution through comparative studies of nucleaotide sequence. J Mol Evd. 1980;16:111–120. [PubMed]
 Knoder CE. Elliot’s Pheasant conservation. World Pheasant Assoc J. 1983;8:11–28.
Kumar B, Tamura K, Jakobsen IB, et al. MEGA2: Molecular Evolutionary Genetics Analysis Software. Tempe, Arizona, USA: Arizona State University; 2001. [PubMed]
Randi E, Lucchini V. Organization and evolution of the mitochondrial DNA control region in the avian Genus Alectoris. J Mol Evol. 1998;47:449–462. [PubMed]
Rozas J, Rozas R. DnaSP version 3: an integrated program for molecular population genetics and molecular evolution analysis. Bioinformatics. 1999;15:174–175. [PubMed]
Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2nd Ed. Cold Spring Harbor, N.Y.: Cold Spring Harbor Laboratory Press; 1989.
Thompson JD, Gibson TJ, Plewniak F, Jeanmougin F, Higgins DG. The ClustalX windows interface: flexible strategies for multiple sequence alignment aided by quality analysis tools. Nucleic Acids Research. 1997;24:4876–4882. [PMC free article] [PubMed]
Zheng GM, Wang QS. China Red Data Book of Endangered Animals: Aves. Beijing, China: Science Press; 1998. (in Chinese)

0 komentar:

Post a Comment